許多膽固醇氧化產物具有生物活性,如:細胞毒性、致動脈粥樣化性 和誘變性等。以前從來不認為atheronal會在人類身體內出現,我們已經研究了它們對動脈粥樣硬化主要方面的影響。 這些分子對粥樣動脈中出現的一系列細胞類型是有細胞毒性的;共同引入〔coadministration〕低密度脂蛋白(LDL),它們在組織巨噬細胞中觸發形成泡沫細胞(圖4):并且依靠與LDL的結合〔binding to〕,在 B-100載脂蛋白的二級結構中引起顯著的時間依賴損失〔loss〕  (圖 S5)。更深層次的研究正在進行, 以充分說明動脈粥樣硬化疾病中4a和5a的作用。

   這個試驗證據說明了: ( i)經 PMA處理的斑塊物質通過具有臭氧分解標記的過程產生一種可以與食用靛藍的雙鍵反應的分子種類;  ( ii)膽固醇的△^5，6一雙鍵被氧化, 產生了 atheronals,這是只有臭氧才有的過程。這是動脈粥樣硬化性班塊能夠產生臭氧的有力地使人信服的證據。因為在PMA活化〔mactivation〕之前,已切除的動脈粥樣性斑塊中出觀了只有臭氧化膽固醇才有的氧化產物4a和5a,這似乎說明:在疾病演變的整個過程中都會形成臭氧。不管怎樣，從動脈中取得的粥樣硬化性物質是比我們以前研究的更加復雜的系統;我們不排除通過化學或生物化學途徑之一產生臭氧,如果存在這種途徑的話,它可能不得不通過 PMA 觸發而(產生臭氧)。

這里出現的結果意味著：臭氧的內源性產物可能是動脈粥樣硬化的一種影響因素, 并且也可能與其他膽固醇累積和氧化的影響因素聯系起來,炎癥和細胞損傷可能促進這種疾病的發病機制。直到現在,因為生物學上的關系, 二氧分子氧是氧的唯一存在形式。 在生物體中產生三線態氧種類的發現改變了在活的有機體內氧化劑化學的前景; 并且能夠導致新反應途徑和反應產物的發現; 這些在正常狀態和病理狀態中是非常重要的 。

圖1,經PMA處理的人類粥樣硬化性斑塊把食用靛藍l氧化成靛紅磺酸2。(A)通過經 PMA活化的粥樣硬化性病變, 1漂白的終端觀察。每個小瓶中盛放著等量的1和牛過氧化氫酶(50μg)的PSB(10mM磷酸鈉, 150mM Nacl) (pH值=7.4) 的溶液(≈200μM)的粥樣硬化性斑塊的膠體溶液(≈50mg濕重)。上圖是在DMSO 中加入 PMA (10μL, 40μg/mL)溶液后30分鐘再加人右邊小瓶中的照片(等體積的 DMSO加人左邊的小瓶中)。反應物的總體積是1mL。在所有的情況下,只加人DMSO時,卻沒有發生1的可見吸光率的漂白作用。 A圖上方是1 (左圖)和2 (右圖)的分子結構。 (B) A圖顯示的兩小瓶上清液的反相HPLC分析,靛紅磺酸2的R_T≈9.71min。 (C)人類粥樣硬化性斑塊物質在存在(100μg)牛過氧化氫酶的PBS (pH7.4)重水H₂¹⁸O(>95%)溶液中, 分別用PMA(40μg)活化并離心后,所得上清液的陰離子電子衍射質譜圖,如(A) 中所述。 M/Z,質子—電子比〔mass-charge ratio〕

圖2 (A)膽固醇的化學式,  (3)的臭氧分解產物5, 6—斷固醇(4a)、 羥醛縮合產物(5a) 和它們相應的腙衍生物4b和5b。形成腙的條件下.，在衍生作用過程中, 從4a形成5b的數量約為 20% （用 HPLC法確定）。5a和5b的構型分配如文獻的描述。  (B)合成的脫水產物6a及其 DNPH衍生物6b。（R_T≈18min、〔M-H〕^- =579,圖3，A, B和D)

圖3 DPEs 和腺4b, 5b和6b的可信合成樣品的液相色譜和質譜分析。條件是: DNPH衍生作用后的班塊萃取物, adsorbosphere - HS reverse - phase C18 column,75%乙腈、20%水、5%甲醇,流速為0.5mL/min, 360-nm探測.在線陰離子電子衍射MS (使用 Hitachi M8000儀器)。用PMA(40μg/mL）活化前,  粥樣硬化性病変中, 4b(R_T ≈14.1min)、5b(R_T≈20.5min)和6b(R_T≈18min)。  (A) PMA活化前的斑塊物質; (B)PMA (40μg/mL)活化后的斑塊物質的 HPLC和MS分析(與(A)相同條件下),萃取物用 DNPH (2mM)鹽酸的乙醇溶液進行衍生作用2個小時。 (C-E)合成的4b(C)、合成的6b(D)、合成的5b(E) 的HPLC和MS (插入物)分析。圖(C)、(D)和(E)中每個峰的上方都有一個質量標簽,它們是觀察到的〔M- H〕^-碎片 。所有檢測到的峰都與合成物質的聯合注射進行比較。(F)條形圖表示PMA活化前和活化后,從患者粥樣硬化性病変處提取的4a經衍生作用和萃取作用后, 4b 的測量濃度。 所顯示的數值是活化前和活化后用Graphpad Prism V3 Macintosh儀器進行學生t實驗(雙尾) (p <0.05, n=14)分析而得到的。(G)條形圖表示的是PMA(n=14)活化前和活化后,從患者的粥樣硬化性病變處提取的5a經衍生作用和萃取作用之后, 5b的測量濃度。(H）條形圖表示的是從患者的血漿樣品中提取的5a經衍生作用和萃取作用之后. 5b的測量濃度。 A組 (n= 8) 息者在24小時之內經過了頸動脈內膜切除術(在樣品收集后的3天里進行了血漿分析); B組(n=15)患者是隨機抽取的、并需要普通臨床護理的患者 (在樣品收集后的7天里進行了血漿分析)。5a在體外血漿中的孵化顯現出: 5a的水平S每天下降5% (在室溫條件下）; 5a從血漿中萃取的效率>90%,且萃取物復制的數值在5%之內。在我們的化驗條件下, 4b和5b的檢測極限值是1 — 10nM;這里沒有給出4b和5b的數值,其數值應該< 10nM。

圖4用 atherona1--A4a和 atherona1—B 5a孵化的 LDL誘導巨噬細胞的脂負荷〔lipid—loading〕產生泡沫細胞。 J774.1巨噬細胞和(A) LDL(100μg/ml）或（B）LDL和atheonal-A4a(20μM）一起在加入了2, 6—二叔—丁基—4—甲基苯酚[2，6—di—tert—butyl—4—methylphenol〕的介質中孵化。組胞用4%的甲醛固定,并用蘇木精和油紅氧褪色(放大X100倍的圖像)。 atheronal - B5a對含有J774.1巨噬細胞脂負荷的影響是不能與4a區別開的。