臭氧的生物效應研究：2.腫瘤壞死因子(TNF-a)對人類白細胞的誘導

Luana Paulesu  Enricoluzzi and Velio Bocci

　　生物學測定法
　　釆用Ruff利Gififord(21)提出的修正方法來確定(樣品的)生物活性,簡而言之，L929細胞在每個插孔的細胞通量為4x104的96插孔培養皿中(把10%胎兒腓腸血清(FCS)和抗生素加入100ul Eagle's MEM培養基中)接種【seed】在37℃的潮濕環境(95%空氣?5%CO2)中保溫4h,在分離的96插孔培養皿中，制備進入放線菌素D(Serva, Heidelberg)2ug/ml的兩倍【2-fdld】系列樣品稀釋液。然后，把每種100ul稀釋液轉移到相應的插孔和皿中，進而在潮濕的CO2培養箱中，37C條件下保溫18h。
　　然后，去除上清液，用(0.1%)結晶紫給細胞染色。干燥后，在每個插孔中加入100ul 33%醋酸以溶解燃料。最后，在540nm波段，在Titertek Multiskan microElisa reader上讀取培養皿。用最大細胞毒性的50%稀釋液的倒數定義TNF活性的單位。
　　用生物測定法測量的TNF-a標準溶液來計算轉化因子是可能得，所有報道數據的單位是pg/ml。

　　細胞有絲分裂發生的測量
　　先用臭氧(2.2和11.5ug/ml)或用加入SEB或不加入SEB的無菌空氣處理PBMC懸液(1.5X106細胞/ml),并在三插孔的平底微量滴定皿中培養，每個平底微量滴定皿的最后體積為200ul，并在含5%CO2的潮濕環境中測試DNA合成。在72、96和120h時，每個插孔的培養液用1ugCi［3H］胸腺嘧啶脫氧核苷(sp. Act.5Ci/mmol, Amersham)沖擊［pulse］,然后，再保溫2h,并用Skatron細胞的玻璃纖維過濾器收集［harveste］, Skatron細胞是作為對照(用無菌空氣處理且不加入SEB的細胞)的一個百分率。如果用同樣的培養液進行淋巴因子和增值測定，那么在胸腺嘧啶脫氧核苷沖擊前，應除去100ul上清液。
　　統計評價
　　圖1-3表示的是用不同臭氧濃度處理后得到的峰值與對照組比較的情況。
　　用p<0.001(雙尾)的學生-t-測試進行統計學評價，p＜0.001(雙尾)是顯著性的最小值。
　　結 果
　　我們是通過直接檢査用臭氧處理的血液-模擬臨床實踐的過程-來開始我們的研究的。每個人體血液樣品都用幾種不同濃度的臭氧處理30秒鐘。圖1表示的是TNF-a釋放動力學和臭氧劑量/效應關系的一個典型試驗。臭氧濃度的有效范圍是在30-54ug/ml之間，而20或108ug/ml(數據沒有顯示)顯示出無效，因為這樣的濃度不是太高了就是太低了，并且還可能中毒。我們注意到IFN-y的產生模式有點類似(18),臭氧處理72h后，釋放出大多數IFN-y；而大部分TNF-a是在用臭氧處理后立即釋放出來的。
　　因為紅血球可以抑制［弱化］臭氧的大部分氧化活性和用臭氧處理后產生的過氧化物，所以它與檢查孤立PBMC的響應有關聯。在這些制劑中，紅血球實際上是沉默的，并且這里測試的最低臭氧濃度(2.2ug/ml)變成是最有效的了，而11.5ug/ml的臭氧濃度是很難產生刺激效應的(圖2)；從總體上講，42和108ug/mI的臭氧濃度是抑制TNF-a釋放的。加入SEB后，對照組的樣品沒有顯示出活性來，而24h后,獲得的滴定度是非常髙的(1961=148pg/ml).這樣，培養基中孤立PBMC不僅對非常低的臭氧濃度敏感，而且TNF-a的釋放也提前出現了24h,并在人體內甚至可能發生得更早一些。有趣的是：峰值過后,TNF-a活性的衰變非常迅速，這就意味著，在人體外也發生了TNF-a的結合和分解代謝。值得注意的是：在圖2中同時顯示了生物測定和免疫測定2種方法確定的TNF-a數值，這樣，單核因子的生物活性就變得沒有疑問了。
　　圖3表示的是：經過大約96h的靜止期后僅用2.2ug/ml臭氧處理的PBMC在顯著水平上恢復了胸腺嘧啶脫氧核苷的合并，盡管顯著低于SEB誘導后的測量值；而11.5ug/ml的臭氧濃度在整個保溫期內都抑制它的合并，在以前的文章中也報道了類似降低細胞呼吸的結果。

未完待續......