臭氧的生物效應研究：2.腫瘤壞死因子(TNF-a)對人類白細胞的誘導

Luana Paulesu  Enricoluzzi and Velio Bocci

方 法
　　血樣的準備
　　從乙型肝炎表面抗原和HIV陰性的健康供者抽取100-200ml人類外周靜脈血液,供者的年齡從25-40歲不等。一部分血樣用生理鹽水緩沖液(PBS)和肝素(10U/ml)以1:1的比例進行稀釋，然后就這樣用；而剩余血樣分層后，用Boyum法將Ficoll-Hypaque從PBMC分離開來(19).
　　PBMC 分餾物在 RPMI 1640 培養基(DUTCH Modification, Flow Laboratories, Irvine, Scotland)中重新懸浮，在RPMI 1640培養基中補充進10%的熱鈍化［heat-inactivated］(56℃,60min)胎兒腓腸血清(Bocknec Laboratories Inc.,Canada)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100ug/ml)和最后濃度為1.5x106活力細胞/ml 的L-谷氨酰胺(2mM）。細胞生存力用臺盼藍排除技術和光顯微鏡觀察來測定。

　　血樣的處理和保溫
　　在室溫條件下，將臭氧或無菌空氣(對照組)吹入血樣和PBMC懸液的等分部分(4.5ml),吹入時間是30秒。用Ozonsan PM 80制備臭氧-氧氣混合氣體。在分離樣品中使用的臭氧濃度在2.2-108ug/ml之間。為了檢驗細胞的響應，用絲裂原(葡萄糖球菌腸毒素B, SEB, Sigma, St. Louis, MO)激發［challenge］部分PBMC對照樣品。
　　然后，在37℃的潮濕環境(95%空氣-5%CO2)中，所有樣品在四組中之一［quadruplicate］的96-插孔培養皿(Falcon, Becton Dickinson, Milano, Italy)中保溫 24、48、72 和 96h。在每一時間時，以 1000g 離心分離這些樣品，并將上清液在-80℃條件下冷凍至測定TNF-a含量為止。
　　為了細胞有絲分裂發生，還檢査了一些PBMC培養液。
　　TNF-a活性
　　釆用ELISA法(BIOKINE TNF測試用具包)(T CeIl Science, Cambridge, MA)或者是用L929細胞和放線菌素D的生物測定法來測量TNF-a濃度。這兩種確定TNF-a含量的測試方法都是非常詳細而精確的。
　　ELISA 法測定 TNF-a
　　用三明治酶免疫測定法測定血漿和PBMC培養物上清液中的TNF-a Ag濃度。簡而言之，微量滴定插孔中先吸收了一個老鼠的單克隆抗體抗人TNF,再放入血樣，然后在37℃的空氣培養箱中保溫2h。
　　使用洗液后，加入具有中和性能抗TNF(20)的酶結合單克隆抗體后，再保溫2h.使用洗液的目的是去除結合抗TNF的未結合酶，并將底物溶液放入插孔中。490nm波段對底物胚料［substrate blank］,在Titertek Multiskan microElisa reader(Flow Laboratories)上讀取染色產物，這里，形成的染色產物與樣品中存在的TNF數量成正比。樣品中的細胞因子濃度用pg/ml來表示，用己知TNF濃度的樣品生成的標準曲線來確定。
　　這種測定方法的靈敏度極限是10pg/mL。

未完待續......