以前我們已經證實:在與炎癥有關聯的氧化劑中,只有臭氧能夠把食用靛藍1〔食用靛藍1是一種臭氧的化學捕獲劑〕氧化成靛紅磺酸2,并使靛紅磺酸2從重水H₂¹⁸0中結合來的同位素進入2的內酰胺羰基中(圖1)。這樣,用l作為分析工具,我們研究了:從頸動脈內膜切除手術中得到的粥樣硬化性組織(n= 15).并經佛波醇—豆蔻酸酯—乙酸鹽(PMA)處理,看是否能產生一種具有O₃化學標記性質的氧化劑(圖1)。 在用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS) (pH=7.4)中,把粥樣斑塊樣品分成兩等份; 一份加入二甲基亞砜 (DMSO)中, 另一份加入溶有 PMA的二甲基亞砜(DMSO)溶液中。我們觀察了 PMA溶液中的15個斑塊樣品,其中14 個樣品有可見吸光率的漂白(圖1A) (12),樣品漂白伴隨著靛紅磺酸2的形成,并且斑塊樣品中靛紅磺酸的數值在1.0-262.1nmo1/mg范圍內變化(圖1B,表S1)。粥樣硬化性斑塊物質的 PMA處理是在含PBS(>95%¹⁸0) (n=2)的1的重水 H₂¹⁸O溶液進行的, 1中的內酰胺羰基氧約40%是¹⁸O,這可由孤立分裂產物2質譜圖中的〔mass—H〕^—228和230質量碎片得到的相對強度 〔relative intensities〕看出來, 如圖lC所示。

膽固醇是粥樣硬化性斑塊的主要脂質成分(13),并且在某些病例中出現如此高濃度的膽固醇,能夠在患病動脈的脂質核〔core〕中形成晶體相。以前的研究顯示:在諸如三線態氧 (³O₂)、單線態(¹O₂*)、超氧化物陰離子、 羥基自由基(從 H₂0₂和 Fe²⁺的反應中得到的)和O₃的氧化劑中,只有 0₃能夠使膽固醇3的△^5,6雙鍵斷裂,并且其主要反應產物是5, 6—斷甾醇〔5, 6-secostero1〕4a (圖2A)。這樣,用 PMA處理前和處理后,我們分析了切除的粥樣硬化性斑塊物質(n=14)中是否存在4a；并且用派爾及其同事在化學研究中發展起來的程序來修正。簡而言之,這種方法包括以下步驟: (1)在均質斑塊物質的懸液中加入有機溶劑進行萃取; (2)用二硝基苯肼鹽酸(DNPH HCI)處理此有機萃取液; (3)采用高效液相色譜法和質譜測定法, 來分析衍生斑塊萃取液(DPE)中是否存在4b-2, 4-二硝基苯腙; 4b是4a的衍生物(圖3C)。在14個未活化的 DPEs中的11個 DPEs樣品中和所有活化的 DPEs中,檢測到了腙4b(圖3B),并以4b的平均值作為判斷標準,我們發現:經PMA處理后, 4a的數量顯著升高了(圖3F)。

除了4b,在DPEs的HPLC的分析過程中,觀察到了兩種腙, A峰的保留時同(R_t) ~20.5min、[M-H]^-=597; B峰的R_T)~18.0min、〔M-H〕)^_=579 (圖3, A和 B)。通過比較分析和用可信樣品的共同注射〔co-in- jection〕;認為 A峰是羥醛縮合產物5a的腙衍生物5b,而 B峰是 A—環脫水產物6a的腙衍生物6b(圖3D)

已經知道: 一級或二級胺基團分子可以催化酮和乙醛間的交叉羥醛縮合反應 。 所以, 我們研究了這些存在于斑塊和血液中的成分是否促進了從4a到5a的轉化。研究發現:下列成分會促進這個反應(11): L—脯氨酸(L-Pro) (2小時,完全轉化)、甘氨酸(Gly) (24小時,完全轉化)、 L—賴氨酸·鹽酸(L-Lys-HC1) (24小時,完全轉化)、 L-Lys-2HC1 (乙基酯) (l00小時, 62%轉化)、 粥樣動脈中的萃取液(22小時,完全轉化)、全血(15小時,完全轉化)、血漿(15小時,完全轉化)、血清(15小時,完全轉化)。

綜上所述,由子PMA的活化作用,斑塊中的酮醛4a的數量顯著增加了;但是,不管怎樣,在羥基丁醛5a 的病例中,斑塊活化作用的總效應還不太清楚。觀察了由于斑塊活化作用而導致的5a水平增加(圖3G,患者F 和H)或減少(圖3G,患者C, G和N)的患者病例。同時,我們沒有說明斑塊—斑塊變異性的試驗證據,正在進行的更深層次的研究會回答這個問題的 。

   盡管炎癥是動脈粥樣硬化發病機制的一個影響因素,這一點已為大家廣為接受。但是,不存在什么特定的非侵入式方法,能夠把炎性動脈疾病和其他炎性過程區分開來。我們已分析了存在4a或5a兩組患者的血漿樣品, A組由8名動脈粥樣硬化疾病患者組成,他們的病癥狀態已經到了應該接受動脈內膜切除手術的程度了, B組患者(n= 15)是隨機抽取的,他們接受的是普通臨床護理。在 A組6名患者的樣品中檢測到了羥基丁醛5a, 其數值在70—l690nM之間(圖3H) (我們化驗的檢測極限值是1- 10nM) 。 B組的15個血漿樣品中只在1 個樣品中測試到了5a。在任何患者的血液樣品中都沒有檢測到酮醛4a(我們化驗的檢測極限值是1-10nM)。我們推測這可能是因為: (1) 通過血液中的催化劑將4a轉化成5a; (2) 或者是血漿中的成分對4a和5a的親和力有差別。過去,因為存在膽固醇自氧化的問題,所以,“氧甾類”的血清分析總是因難的(20)。因此,綜上所述, 通過與膽固醇3生物相關的氧化作用, 在膽固醇的所有氧化產物中, 甾族化合物的衍生物4a和5a是只有臭氧氧化膽固醇3才有的產物。盡管這些試驗結果的臨床顯著性研究已經超出了我們目前研究的范目,但是,這意味著:在血漿中存在的羥醛縮合產物5a(作為它的 DNP腙衍生物5b的檢測)能夠成為動脈粥樣硬化中晚期動脈炎癥的一個標志 。