醫用臭氧對肝癌細胞株HepG2突變型p53基因表達的影響

廖旺軍

南方醫科大學南方醫院腫瘤科

二、科學研究/開發內容、方法、技術路線

1、研究開發目標：

(1)構建含p53 249突變片段的質粒。

(2)將構建的質粒轉染肝癌細胞HepG2，并篩選陽性克隆。

(3)根據實驗提供的數據，研究適宜的醫用臭氧濃度，減少其強氧化性帶來的細胞毒性。

2、科學研究內容：

(1)構建含p53 249突變片段的質粒。

(2)構建含p53 249突變片段的質粒后，轉染肝癌細胞，建立p53 249突變的肝癌細胞，并篩選陽性克隆。

(3)通過 暟斮暠型管裝加入臭氧對肝癌細胞產生影響。

①不同的臭氧濃度對氧自由基產生的影響;

②不同的臭氧濃度對p53蛋白表達的影響;

③氧自由基與p53蛋白之間的關系。

3、擬解決的關鍵技術問題：

(1)構建含p53 249突變片段的質粒。將構建的質粒轉染肝癌細胞HepG2，并篩選陽性克隆。

(2)臭氧作為一種強氧化劑，可以滲透細胞膜組織，侵入細胞膜內，作用于外膜脂蛋白和內部的脂多糖，使細胞發生通透性畸變，導致細胞的溶解死亡。為了避免臭氧的這種細胞毒性對實驗結果的影響，這就要求我們在試驗中應該謹慎選擇一個安全有效的濃度范圍。選擇15-35μg/ml的濃度范圍，根據具體實驗結果可做適當的調整。

(3)臭氧的強氧化性和不穩定性給以臭氧為研究對象的實驗帶來了極大的困難，觀察臭氧對離體細胞作用的研究方法操作起來難度較大。本實驗采用bocci等在研究臭氧對內皮細胞和血小板影響的研究中采用的“Y”型管裝，相對來說，操作比較簡單，可控性較好。

4、項目的特色和創新之處：

腫瘤形成后，細胞內的氧自由基水平仍對p53蛋白的表達發揮一定的作用。本研究創新之處在于利用臭氧激活抗氧化酶、清除自由基的的作用，將臭氧用于減少p53蛋白的表達有望應用于臨床化療，減少耐藥的產生，促進肝癌細胞的凋亡。同時，臭氧在減少耐藥的同時還可以起到護肝、增強免疫的作用，而且價格低廉，毒副作用小，是臨床化療的最佳輔助用藥。

5、采用的方法、技術路線以及工藝流程：

①含p53 249突變片段的質粒的構建

以p48-11質粒為模版，P1：gtt ggc tct gac tgt acc acc;P2：ggc atg aac cgg agt cccatc ctc(野生型p53 249 Arg的編碼子為agg，突變后成Ser后的編碼子為agt;P3：gag gat ggg act ccg gtt cat gcc;P4：g tcg ctt agt gct ccc tgg ggg為引物，用PCR方法在p53 249編碼子中引入點突變，使編碼子249由Arg變成Ser。提純、測序，然后再將該產物片段酶切后放回質粒。

②含p53 249突變片段的肝癌細胞的建立

將質粒轉染至人源肝癌細胞株HepG2，將轉染后的肝癌細胞進行培養，篩選出陽性克隆。 陽性克隆的HepG2細胞用含10%胎牛血清的1640于37.2℃，5%CO2細胞培養箱常規培養。

③取對數生長期細胞，1*107接種于24孔板，每孔1ml，分成4組，分別是對照組，醫用臭氧15μg/ml組、醫用臭氧25μg/ml組、醫用臭氧35μg/ml組。12小時后，參照文獻[4]介紹的方法進行臭氧干預：用三通連接管將兩注射器連接成“Y”形， 其中一個注射器自醫用臭氧發生器分別抽取15\25\35μg/ml的醫用臭氧，迅速通過三通連接管注入另外一個注射器(含有與醫用臭氧相同容積的完全培養基)，不斷搖動，作用20min。肝癌細胞經D.Hank液洗滌后，3組醫用臭氧組分別加入醫用臭氧干預后的完全培養基400ul，對照組加入無任何干預的完全培養基400ul，24h后倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

④、檢測指標的變化

MTT測細胞成活率：于加入臭氧溶液1，24，48h后，每孔加入MTT，溫箱孵育2-4h，待出現明顯可見紫色結晶時加入DMSO，置溫箱孵育后，用酶聯免疫檢測492nm波長處吸光度值。

加入臭氧24h后，采用硫代巴比妥酸反應物質法檢測細胞內氧自由基中間產物丙二醛(MDA)的含量，按照試劑盒說明書進行相關操作。

3、加入臭氧24h后，應用免疫組織化學技術檢測細胞的P53蛋白表達的情況。采用即用型第二代免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒，按其操作說明書檢測P53 蛋白。結果判斷：p53 蛋白主要定位于細胞核中，以細胞核內出現棕色顆粒為陽性染色。(一)：陽性細胞數<10%;(+)：陽性細胞數介于10%∽30%;(++)：陽性細胞數介于30%∽60%;(+++)：陽性細胞數≥60%。

⑤、應用統計學方法對實驗結果進行分析

以上實驗至少重復棾次，實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSSI6.0軟件進行方差分析、q檢驗

及秩和檢驗對實驗結果進行分析。